siRNA(小干擾RNA)是一種新型的基因治療工具,是由21-25個(gè)核苷酸組成的雙鏈短RNA分子,能夠特異性地誘導(dǎo)靶基因的沉默,進(jìn)而抑制蛋白的表達(dá)。siRNA最初由Andrew Fire和Craig Melo在1998年提出,之后在2001年被證明可以特異性地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的靶基因表達(dá)。
siRNA的抑制作用是通過其與AGO蛋白組裝成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)發(fā)揮的。一條鏈被降解,另一條鏈則與靶基因的mRNA互補(bǔ)配對(duì),使其被切割降解,從而達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。與傳統(tǒng)的基因治療相比,siRNA具有高度特異性、快速、可逆性等優(yōu)點(diǎn),可以應(yīng)用于各種真核生物的基因功能研究,藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用。例如siRNA靶向惡性腫瘤的基因可以通過局部或系統(tǒng)性給藥來治療腫瘤,病毒感染和遺傳疾病也都有涉及。
為了方便使用,常規(guī)siRNA產(chǎn)品以凍干粉形式提供,可以直接用于各種細(xì)胞RNAi實(shí)驗(yàn)??蒲腥藛T可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)特定靶點(diǎn),覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因。同時(shí),通過對(duì)siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾,可以提高其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的高效性、特異性和穩(wěn)定性。
RNA干擾(RNAi)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程,常常被用作基因沉默(基因干擾)的工具之一。siRNA作為RNAi的一種形式,具有非常廣闊的應(yīng)用前景。未來,siRNA還將繼續(xù)發(fā)揮其優(yōu)勢(shì),成為治療相關(guān)疾病的新趨勢(shì)。
siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)介紹
01- siRNA儲(chǔ)存
常規(guī)化學(xué)合成的siRNA序列為21~23nt的雙鏈小分子RNA,為凍干粉形式的即用型試劑 ,在常溫不溶解的情況下可以保存至少1個(gè)月時(shí)間,放置于-20℃~-80℃低溫環(huán)境中,凍干粉可以穩(wěn)定保存一年。
02- 轉(zhuǎn)染試劑儲(chǔ)存
4℃保存,不可冷凍。
03-體外轉(zhuǎn)染操作流程:
第一步、接種細(xì)胞:建議提前一天接種細(xì)胞,接種數(shù)量參考下方推薦量。
第二步、 轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制:
● siRNA稀釋液配制:siRNA以水稀釋至140 μg/mL。
● siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制:取無菌離心管,加入2μL siRNA稀釋液,加入LipidnanoTM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑A液14μL,吹打混勻,加入LipidnanoTM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑B液4μL,混合均勻,室溫放置5min,加培養(yǎng)液180μL,吹打混勻。
第三步、細(xì)胞加樣:按下方推薦量將配制好的siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液加入各細(xì)胞孔中,搖動(dòng)培養(yǎng)板,輕輕混勻。
第四步、細(xì)胞培養(yǎng):37 ℃,5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng),直至發(fā)揮干擾作用。建議24~48h測(cè)定mRNA水平、48~72h測(cè)定蛋白水平。